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HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法

1 合用规模

      本规范划定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。

 ;     本规范合用于地表水、公然水、糊口污水和产业废水的急性毒性测定。

2 规范性援用文件

      本规范内容援用了以下文件中的条目。但凡不注日期的援用文件,其有用版本合用于本规范。

      GB/T 6920 水质 pH 值的测定 玻璃电极法

      GB/T 13267 水质 物资对海水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方式

      HJ 91.1 污水监测手艺规范

      HJ 506 水质 消融氧的测定 电化学探头法

      HJ/T 91 地表水和污水监测手艺规范

      HJ/T 164 公然水情况监测手艺规范

3 术语和界说

      以下术语和界说合用于本规范。

3.1

      鱼卵 fish egg

     ; 指处于卵膜分裂前全部发育阶段的卵细胞,斑马鱼卵相干发育阶段参见附录 A

3.2

      浓缩倍数 dilution level

      原水样占浓缩后水样整体积分数的倒数,普通用 D 来表现。比方,水样未浓缩,则浓缩倍数 D=1;取 250 ml 水样浓缩至 1000 ml(即体积分数为 25%),则浓缩倍数D=4

3.3

      最低有效应浓缩倍数 lowest ineffective dilution

      测试中不发生测试效应的最低浓缩倍数,本规范指不少于 90%鱼卵存活时水样的最低浓缩倍数,用 LID 表现。

3.4

      半数效应浓度 EC50

      指裸露48 h 后使50%斑马鱼卵发生效应的原水样占浓缩后水样整体积的百分数,用EC50表现。本规范中 EC50 即半数致死浓度 LC50

3.5

      参比物资 reference substance

      测试中,用于考证方式敏理性的已知阳性对比物资,如本规范中 3,4-二氯苯胺。

4 方式道理

 ;     利用多孔细胞培育板,在微孔板对比、阳性对比和阳性对比节制的前提下,将 4-细胞期~128-细胞期的斑马鱼受精卵置于差别浓缩倍数的水样中,在 26℃±1℃的前提下培育 48 h,根据鱼卵存活与灭亡的统计数据计较 LID EC50 值,表征水样的急性毒性。

5 搅扰和消弭

      水样浊度或色度搅扰测试起点判定,可用塑料滴管(7.11)迟缓从多孔细胞培育板(7.8) 中吸出必然量的水样后再行观察,防止触碰鱼卵;观察竣事后,若需持续裸露,则用塑料滴管(7.11)将原水样移回,规复原有裸露体积。

6 试剂和资料

6.1 受试生物

6.1.1 种鱼

      利用硬朗、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长 3.5 cm 摆布,鱼龄在 6 月~24 月之间。安康雌鱼腹部银亮,饱满膨大。安康雄鱼体型苗条,腹部扁平,身材带有金黄色光芒。种鱼在产卵前 6 个月不予利用任何药物。种鱼驯养及保持详细前提见附录 B

6.1.2 鱼卵

      确保尝试鱼卵受精率70%,处于 4-细胞期~128-细胞期(见附录 A)。

6.2 试剂

      除非还有申明,阐发时利用合适国度规范的阐发纯试剂。尝试用水利用新制蒸馏水或去离子水,知足 pH 6.58.5,电导率<10 μS/cm 的请求。

6.2.1 氢氧化钠(NaOH)。

6.2.2 氯化钙(CaCl2·2H2O)。

6.2.3 硫酸镁(MgSO4·7H2O)。

6.2.4 碳酸氢钠(NaHCO3)

6.2.5 氯化钾(KCl)。

6.2.6 3,4-二氯苯胺(C6H5Cl2N),优级纯。

6.2.7 盐酸:ρ(HCl=1.19 g/ml

6.2.8 盐酸溶液:cHCl=0.1 mol/L

      量取 8.3 ml 盐酸(6.2.7),用水定容至 1 000 ml

6.2.9 氢氧化钠溶液:cNaOH=0.1 mol/L

      称取 4 g 氢氧化钠(6.2.1),溶于少许水中,用水定容至 1 000 ml

6.2.10 参比物资 3,4-二氯苯胺储蓄液:ρ(C6H5Cl2N=100 mg/L

      称取 0.05 g 3,4-二氯苯胺(6.2.6),溶于少许规范浓缩水(6.2.16)中,用规范浓缩水(6.2.16)定容至 500 ml,静置 24 h,调理 pH 值至 7.0。避光冷藏保管,储蓄液可贮存 6 个月。

6.2.11 参比物资 3,4-二氯苯胺任务液:ρ(C6H5Cl2N=3.7 mg/L

      量取 3.7 ml 参比物资 3,4-二氯苯胺储蓄液(6.2.10),用消融氧浓度达氛围饱和值的规范浓缩水(6.2.16)定容至 100 ml,利用前按 8.2.1 步骤均衡至 26℃±1℃。该溶液作为阳性对比,临用前现配。

6.2.12 氯化钙储蓄液:ρ(CaCl2·2H2O=11.76 g/L

      称取 11.76 g 氯化钙(6.2.2),溶于少许水中,用水定容至 1 000 ml。可贮存 6 个月。

6.2.13 硫酸镁储蓄液:ρ(MgSO4·7H2O=4.93 g/L

      称取 4.93 g 硫酸镁(6.2.3),溶于少许水中,用水定容至 1 000 ml。可贮存 6 个月。

6.2.14 碳酸氢钠储蓄液:ρ(NaHCO3=2.52 g/L

      称取 2.52 g 碳酸氢钠(6.2.4),溶于少许水中,用水定容至 1 000 ml。可贮存 6 个月。

6.2.15 氯化钾储蓄液:ρ(KCl=0.22 g/L

      称取 0.22 g 氯化钾(6.2.5),溶于少许水中,用水定容至 1 000 ml。可贮存 6 个月。

6.2.16 规范浓缩水。

      将氯化钙储蓄液(6.2.12)、硫酸镁储蓄液(6.2.13)、碳酸氢钠储蓄液(6.2.14)和氯化钾储蓄液(6.2.15)四种储蓄液各 25 ml 夹杂,用水定容至 1 000 ml

7 仪器和装备

7.1 冷藏采样箱:2℃~8℃;

7.2 pH 计:丈量规模 014,最小分度为 0.1 pH 单元;

7.3 消融氧测定仪:丈量规模 0 mg/L20 mg/L,最小分度为 0.1 mg/L

7.4 颠倒显微镜或体视显微镜:最小缩小倍数为 30×;

7.5 冰箱:冷藏室 2℃~8℃;冷冻室≤-18℃;

7.6 恒温培育箱或恒温室:温度可调至 26℃±1℃;

7.7 斑马鱼养殖体系:包含清水、储水、供水、水质节制及轮回等体系;

7.8 多孔细胞培育板:每孔容积 2.5 ml5 ml 或接纳别的不异功效的细胞培育板,可挑选市售;

7.9 产卵盒:惰性资料,保举尺寸:20 cm×10 cm×11 cm(参见附录 C),可挑选市售;

7.10 温度计:0℃~50℃;

7.11 塑料滴管:5 ml,口径大于 3 mm

7.12 普通尝试室经常利用器皿和装备。

8 样品

8.1 样品的收罗和保管

      根据样品性子及监测须要利用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶(或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器)根据HJ 91.1HJ/T 91 HJ/T 164 的请求停止水样的收罗,水样沿瓶内壁迟缓倒入,并与瓶塞间不留空地。

      水样收罗后,当即于 2℃~8℃避光运输和保管,并尽快停止尝试,保管时候最长不跨越 48 h。水样若需持久保管,则上述水样收罗后应尽快送回尝试室冷冻(≤-18℃)保管, 保管前将水样充实混匀后按每 1000 ml 容器艳服 500 ml700 ml 水样的量分装,保管期不跨越 2 个月。

8.2 样品预处置

8.2.1 温度

      冷冻保管的水样需在不跨越 25℃水浴轻细振荡冻结,或在 2℃~8℃冷藏留宿冻结。受试水样在尝试起头前,安排于恒温培育箱或恒温室(7.6)中,26℃±1℃避光均衡至恒温后用于尝试。

8.2.2 pH

      根据 GB/T 6920 方式测定水样 pH 值。当 pH 值<6.5 pH 值>8.5 时,利用盐酸溶液(6.2.8)或氢氧化钠溶液(6.2.9)调理水样 pH 值至 6.58.5,尽可能削减酸碱调理液的用量, 以削减对水样浓度的影响。测定并记实调理后的水样 pH 值,按后续步骤停止水样测定。

      当 pH 值的影响须要反映在尝试成果中或调理 pH 值会引发水样物理变性或化学反映时,则不调理水样 pH 值。

根据水样测定的现实需要,也可对 pH 值调理前后的水样同时展开尝试比拟。

8.2.3 消融氧

      根据 HJ 506 方式测定水样消融氧浓度,确保用于裸露尝试(9.3)步骤中的每个浓缩水样中初始消融氧浓度不低于 4 mg/L(约莫 50%饱和度)。若要充氧,消融氧浓度不跨越呼应饱和消融氧值。

8.3 样品浓缩

8.3.1 预尝试

      当浓度难以预估时需停止预尝试,以浓缩比为 10 挑选 3 个持续浓度的浓缩水样,每浓度以 5 粒鱼卵按 9.39.6 局部停止尝试,以肯定鱼卵灭亡率 100%0%与浓缩水样浓度大抵对应的规模。

 

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