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HJ 1190-2021 水质 灭菌生物唆使物(枯草芽孢杆菌 玄色变种)的判定 生物学检测法

      正告:检测职员应接纳须要的生物宁静防护办法(包含但不只限于一次性手套、口罩、防护服、防护眼镜、鞋套等防护用品);检测时应做好无菌防护,在无菌操纵装备内停止。

1 合用规模

      本规范划定了判定水中灭菌生物唆使物(枯草芽孢杆菌玄色变种)的生物学方式。

      本规范合用于微生物尝试室灭菌成果的评估。

2 规范性援用文件

      本规范援用了以下文件或此中的条目。但凡申明日期的援用文件,仅注日期的版本合用于本规范。但凡未注日期的援用文件,其最新版本(包含一切的点窜单)合用于本规范。

      《消毒手艺规范》(原卫生部卫法监发〔2002〕282 号)

3 术语和界说

      以下术语和界说合用于本规范。

3.1

      枯草芽孢杆菌玄色变种 Bacillus subtilis var. niger

      也称萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),在含酪氨酸的培育基上构成玄色素的革兰氏阳性芽孢杆菌。作为灭菌成果评估尝试的唆使菌种。

3.2

      灭菌 sterilization

      物理或化学的方式杀灭全数微生物,包含致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒卵白,使之到达无菌保障程度。经常利用的灭菌方式有化学试剂灭菌(如环氧乙烷、甲醛等)、射线灭菌(如γ射线、电子束辐射等)、干冷灭菌、干热灭菌和过滤除菌等。

3.3

      生物唆使物 biological indicator

      含有对特定灭菌进程具备必然耐受力的活微生物的生物成品。

     ; 注:生物唆使物为特定灭菌进程是不是知足杀灭指定数目微生物的必须前提供给信息,并划定该进程的相信程度。

4 方式道理

      经灭菌措置后含枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢的水样经由过程孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤,细菌和芽孢被扣留在滤膜上,而后将滤膜置于酪氨酸琼脂培育基上,36 ℃±1 ℃培育 72 h~96 h,枯草芽孢杆菌玄色变种发生的酪氨酸酶可分化并操纵酪氨酸构成玄色素,发生玄色的特点菌落。对特点菌落停止染色镜检后经由过程生化尝试做进一步判定,能操纵甘油和甘露糖,可复原硝酸盐和水解淀粉,不能操纵苦杏仁苷和甘露醇,并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特点菌落为枯草芽孢杆菌玄色变种,判定成果为阳性。

5 试剂和资料

      除非还有申明,阐发时均利用合适国度规范的阐发纯试剂,尝试用水为蒸馏水。

5.1 酪氨酸琼脂培育基,见附录 A.1。

5.2 养分琼脂培育基,见附录A.2。

5.3 淀粉培育基和碘液,见附录 A.3。

5.4 硝酸盐复原培育基和相干试剂,见附录A.4。

5.5 甘油复红肉汤培育基,见附录A.5。

5.6 甘露糖生化培育基,见附录 A.6。

5.7 甘露醇生化培育基,见附录 A.6。

5.8 苦杏仁苷生化培育基,见附录A.7。

5.9 革兰氏染色液,见附录 A.8。

5.10 芽孢染色液,见附录 A.9。

5.11 阳性对比菌:如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

5.12 阳性对比菌:枯草芽孢杆菌玄色变种(Bacillus subtilis var. niger)。

5.13 枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢悬液:根据《消毒手艺规范》2.1.1.2.3(2)的划定制备,也可采办浓度规模在 106 CFU/ml~109 CFU/ml 之间的市售枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢悬液。

5.14 无菌滤膜:直径 50 mm,孔径 0.45 μm 的醋酸纤维滤膜。

      按无菌操纵请求包扎,经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min,晾干备用;或将滤膜放入烧杯中,插手尝试用水,煮沸灭菌 3 次,15 min/次,前 2 次煮沸后需换水洗濯 2~3 次。也可接纳市售的无菌滤膜。

5.15 白腊质封口膜。

5.16 无菌水:取适当尝试用水,经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min,备用。

      注 1:5.1~5.10 的成份及制备方式见附录 A,也可利用市售商品化培育基或染色液;

      注 2:5.11~5.12,倡议采办由国际或国际菌种收藏机构收藏的遗传学特征获得确认和保障并可追溯的规范菌株。

6 仪器和装备

6.1 样品瓶:螺口带盖或磨口具塞的 250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。

6.2 恒温培育箱:36 ℃±1 ℃。

6.3 高压蒸汽灭菌器:121 ℃,可调。

6.4 pH 计:精确到 0.1 pH 单元或更高精度。也可利用 pH 紧密试纸。

6.5 显微镜:物镜 4×或 5×、10×、20×、40×,油镜 100×,目镜 10×或 15×。

6.6 阐发天平:现实分度值 0.0001g。

6.7 培育皿:直径 90 mm。

6.8 过滤装配:配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵,抽滤压力不低于-50 kPa。

6.9 接种环:直径 1 mm~3 mm。

6.10 镊子:不锈钢或一次性无菌塑料镊子。

6.11 刻度移液管:1 ml、10 ml。也可利用可调式移液器。

6.12 量筒:100 ml。

6.13 锥形瓶:100 ml。

6.14 酒精灯。

6.15 试管:10 ml。

6.16 无菌操纵装备:无菌室、超净任务台、生物宁静柜。

6.17 普通尝试室经常利用仪器和装备。

      注:尝试前,移液管、样品瓶、培育皿、锥形瓶、试管、砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗等玻璃器皿应按无菌操纵请求包扎,高压蒸汽灭菌器(6.3)中 121℃灭菌 20 min,烘干,备用。也可接纳干热灭菌(135℃~140 ℃灭菌 3 h~5 h,或 160℃~170℃灭菌 2 h~4 h,或 180℃~200℃灭菌 0.5h~1h)。

7 样品

7.1 样品收罗

7.1.1 评估利用低温高压灭菌装备的灭菌成果时,取样品瓶(6.1),插手枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢悬液(5.13)及 200 ml 无菌水(5.16)使夹杂液中枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢终浓度到达 5×104 CFU/ml~ 5×105 CFU/ml。灭菌措置终了后,掏出样品瓶,对水样停止灭菌生物唆使物(枯草芽孢杆菌玄色变种) 的检测。

7.1.2 评估利用别的灭菌装备的灭菌成果时,灭菌前取适当枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢悬液(5.13)插手灭菌装备,使水样中枯草芽孢杆菌玄色变种芽孢终浓度到达 5×104 CFU/ml~5×105 CFU/ml。灭菌措置终了后,从灭菌装备中收罗水样,停止灭菌生物唆使物(枯草芽孢杆菌玄色变种)的检测。采样量普通为样品瓶容量的 80%摆布,不得用样品洗濯样品瓶。样品收罗终了后,敏捷用无菌包装纸包扎样品瓶。

7.2 样品保管

      样品收罗后宜在 2 h 内检测,不然应在 10 ℃以下冷藏保管运输,但不得跨越 6 h。尝试室领受样品后,不能当即展开检测的,样品应在 4 ℃以下冷藏保管,并在 2 h 内检测。

      注:宜利用生物宁静周转箱停止样品周转。

8 阐发步骤

8.1 方式法式

      样品中枯草芽孢杆菌玄色变种的检测法式见图 1。

8.2 样品过滤

      用无菌镊子(6.10)以无菌操纵夹取无菌滤膜(5.14)贴放在已灭菌的过滤装配(6.8)上,牢固好过滤装配。将样品充实混匀后取 100 ml 抽滤,以无菌水(5.16)冲刷滤器内壁 2~3 次。

 

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下载地点:《HJ 1190-2021 水质 灭菌生物唆使物(枯草芽孢杆菌 玄色变种)的判定 生物学检测法

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